frontiers

刊登期刊：Frontiers in Pharmacology    2022 年 7 月 4 日

論文標題：

VF-101 是一種基於草藥的配方，可阻斷 SARS-CoV-2 的 Delta 和 Omicron 變體的病毒感染

簡介：

自從一種名為SARS-CoV-2 的新型冠狀病毒於 2019 年底爆發以來，它已迅速成為一種流行病，世界衛生組織已宣佈為緊急問題。臨床特徵顯示，患者出現短期肺炎（霍爾舒等人，2020) 然後發展為多器官衰竭 (Mokhtari 等人， ，2020）。在重症患者中，冠狀病毒會引起炎症反應和相關的淋巴細胞減少。盧卡斯等人， 2020）。 SARS-CoV-2 刺突蛋 白與 ACE2 受體的結合促進了病毒的進入、複製和新病毒粒子的形成，然後釋放出新的病毒顆粒，從而引發炎症和細胞因子風暴的失調。王等人， 2020a）。

嚴重的 COVID-19 患者遭受細胞因子風暴，導致致命的 ARDS，發病率為 41.8%，或不可逆的肺纖維化。吳等人 2020）。這種不受控制的全身性過度炎症可以由兩種主要介質調節：鐵蛋白和 miRNA。以前的出版物表明，在重症患者中增加鐵蛋白水平（ Cheng et al., 2020a) 及其 miRNA 的譜與細胞因子的高表達密切相關（帕拉尼薩米等人， 2012;加斯帕雷洛等人， 2021）。

儘管確定了 COVID-19 的進展和潛在機制，但僅使用了 11 種緊急治療方法和僅 2 種批准的藥物（藥物評價中心， 2020）。目前所有這些藥物都是針對單一靶點或作用機製而設計的，例如，瑞德西韋是一種抗病毒複製藥物，而巴瑞替尼托珠單抗是免疫調節劑。然而， SARS-CoV-2 誘導了複雜的信號傳導，即阻斷單一功能會導致治療效率低下。阿爾法（α）、貝塔（β）、伽瑪（γ）、德爾塔（δ）和奧微米（ο）等新突變株的出現，其傳播和感染率比武漢野生非典高出 CoV-2引起了人 們對疫苗功效的擔憂（侯賽因等人， 2021）。因此，發現多功能藥物備受關注。在這項研究中，一種潛在的藥物不僅用於預防疾病的發生，還用於治療COVID-19 患者。為了發現COVID-19 病理機制的完全阻斷劑，生物信息學分析平台提出了能夠通過病毒複製、細胞因子風暴和 ARDS 等多種生物學功能抑制這種疾病的藥物。通過掃描數據庫中的1200 個複合配置文件 (Huang et al., VF-101 是一個很有前途的候選者，可以通過基因集富集分析 (GSEA) 逆轉 SARS-CoV-2 感染特徵（ Subramanian 等人， 2005a）。

裡面的一些成分 VF-101 包括槲皮素、橙皮苷、染料木黃酮、黃豆苷元和白藜蘆醇，具有很強的抗氧化和抗炎作用。海邁萊寧等人， 2007;Parhiz 等人， 2015 年 ;Sá Coutinho 等人， 2018年）。根據未發表的臨床觀察，藥理特性包括預防和治療流感、放療/化療的二級治療、降低哮喘發作頻率、抗炎、激活腫瘤細胞凋亡、抑制癌症轉移和損傷基因修復。此外，生物途徑 VF-101 通過數據庫集成的另一個大數據系統（ KEGG（金久等人 2020), 基因本體論(GO) (Ashburner 等人， ，2000) 和疾病本體 (DO) (杜等人2009;Schriml 等人， 2019））。VF-101 有力地改善了鐵死亡、細胞因子、 miRNA和 ARDS之間的聯繫； COVID-19 經常報告這些作用機制。所以， VF-101 可介導 SARS-CoV-2 誘導的各種病理信號，並提供綜合抑制以緩解患者的症狀。VF-101 是一種出色的 草藥配方 ，可以調節細胞因子分泌並影響其他靶向途徑以全面中斷病毒感染。

另一個目標是 miRNA，它在細胞過程中作為關鍵調節劑發揮了關鍵作用。根據Gonzalo 等人的報導。 (通過 Gonzalo-Calvo 等人， 2021 和凱齊爾斯基等。 (法爾等人，2021)，兩個團隊在住院的 COVID-19 患者中檢測到 miRNA 表達列表。在這兩項研究中，有四種常見的 miRNA 可調節炎症反應（ miR-150-5p和 miR-148a-3p) 和病毒感染 (miR-92a-3p和 miR-491-5p）。根據以往的研究，讓 -7a和 miR-148b預計將針對不同區域的 SARS-CoV-2 基因組（李等 人， 2021）。病毒複製也可以通過抑制病毒的活性來抑制米親它可以在開放閱讀框 (ORF) 1 上切割兩個重疊的多蛋白 pp1a 和 pp1ab，以促進更多的正鏈基因組RNA。

因此，我們假設 VF-101 可以誘導水平讓 -7a和 miR-148b並抑制米親，在冠狀病毒生命週期中發揮關鍵作用，並阻止 SARS-CoV-2 複製（戴等人， 2020)。 VF-101 可以同時激活這個 miRNA 子集並抑制細胞因子風暴，這可能是 COVID-19 治療的潛在治療方法。由於病毒複製過程需要鐵（米哈爾斯基等人，2022），巨噬細胞吸收鐵以降低病毒鐵的生物利用度以抑制病毒複製（ Yue et al., 2010）。

然而，巨噬細胞中過量的鐵積累會導致磷脂氧化受損，最終引發一種特定形式的程序性細胞死亡，稱為鐵死亡。欣茨等人， 2007）。胱氨酸 /谷氨酸逆向轉運體 xCT 和穀胱甘肽過氧化物酶 4 (GPX4) 介導針對鐵死亡的細胞機制，用於穀胱甘肽生物合成和抗氧化防禦。阿德等人， 2021）。研究表明，了解和靶向巨噬細胞可能有助於提高 COVID-19 治療的療效。前面的描述改善了鐵代謝、免疫系統和 ARDS 之間的相關性。 

最後一個假設函數 VF-101 改變了鐵代謝的穩定性並導致抑制炎症反應以治療COVID-19 中的 ARDS。在這項研究中，我們用於潛在SARS-CoV-2 治療的藥物篩選平台顯示， VF-101 可以逆轉COVID-19 的獨特特徵。此外， VF-101 能夠阻止 SARS-CoV-2 刺突的結合和進入，在Delta 和 Omicron 變體中最有效，從多種變體到 ACE2。

在重症 COVID-19 患者的血漿中發現的高水平鐵蛋白也導致了鐵死亡和細胞因子風暴，導致致命的 ARDS。 VF-101 能抑製鐵死亡和 TNF-α的釋放量。此外， VF-101 可以通過抑制病毒來減少病毒複製米親和提高水平 miR-148b-5p. 這些靶向 miRNA 的誘導會下調促炎細胞因子的釋放。 VF-101 還顯示出其改善博來黴素 (BLM) 誘導的 ARDS 大鼠病情的能力。 VF-101 治療後纖維化相關蛋白表達降低表明其作為抗纖維化劑的作用 。

實驗結果：

基因集富集分析揭示了 COVID-19 的反向特徵

為了篩選COVID-19 候選治療，分析了不同藥物治療的轉錄組反應譜，以確定給定藥物是否可以逆轉疾病特徵基因組。 COVID-19、 CRS 和 ARDS 的特徵是基因在疾病狀況下被上調或下調，反向特徵是指在疾病狀況下增加 /減少的基因，可能會因藥物治療而減少 /增加。Blanco-Melo 等人描述了 COVID-19 特徵。 (2020) 與其他呼吸道病毒相比，涉及由 SARS-CoV-2 感染誘導的基因的更大上調或下調，表明 COVID-19 具有獨特的特徵。這些基因組被整合到 MSigDBGSEA 分析數據庫。結果表明 VF-101 GSEA 分析還表明 VF-101 在減少 CRS 方面的作用。 CD4+ T 細胞中的 IL-6 信號傳導減少（ NES = -2.41 q 值 = 0.003），干擾素 -β 處理在支氣管上皮細胞中下調的基因增加NES = 1.62 q 值 < 0.25），表明通過 VF-101 處理降低了 IL-6和增加了乾擾素 -β的分泌（補充表 S1）。 VF-101 對 ARDS 的影響也通過使用 ARDS 特徵的 GSEA 分析進行了檢查。 ARDS 特徵是通過來自 ARDS 患者 (GSE76293) 的血液多形核中性粒細胞 (PMN) 中顯著上調 /下調的基因實現的。 陽性 NES NES = 1.87 q 值 = 0.01）表明 VF-101 可以增強 ARDS 患者的下調基因。

（圖 1A；補充表 S1）

大數據分析表明鐵死亡和 miRNA 是 VF-101 治療 COVID-19 治療的潛在目標

VF-101 的潛在作用機制可以通過藥物治療基因表達圖譜來揭示。對治療的轉錄反應已經描述了低劑量（66.67 微克/ml) 的 VF-101 BEAS-2B 細胞的治療。低劑量導致 6 個上調基因和 8  個下調基因 VF-101 處理（補充表 S2B）。KEGG  富集顯示 VF-101 功能與鐵死亡、 HIF-1  信號通路、類固醇代謝和癌症中的 miRNA  有關（圖 1B）。此外，GO  顯示了 30 介導鐵離子穩態、甾醇代謝過程、病毒受體活性和網格蛋白-塗層坑（圖 1C）。VF-101 轉錄組反應譜通過 DisGeNET 數據庫，其中前 10 位相關疾病包括鐵代謝障礙、氣道阻塞、肺動脈高壓和特發性肺動脈高壓（圖 1D）。高 VF-101 劑量（500 微克/ ml）證明了來自 GO 結果的 microRNA 調節（補充圖 S2A），而 KEGG 條形圖顯示治療與對轉化生長因子-β 的反應和對氧水平的反應相關（補充圖 S2B）。一般來說，它建議 VF-101 介導細胞鐵離子穩態、 miRNA 和病毒感染信號傳導以抑制 COVID-19  症狀。

兩種不同劑量的治療 VF-101 已經通過它們對基因表達水平和相關疾病的影響進行了比較。在兩種藥物濃度下，兩個 DEG 上調，四個 DEG 下調；然而，STC2 是唯一一個表達水平發生顯著變化的基因。VF-101 增加（補充圖 S2C）。大約 700  個基因被較高劑量的藥物誘導或抑制 VF-101，並且這些 DEG 在較低劑量的 VF-101，意味著控制和治療之間沒有區別。低劑量和高劑量的藥物可以乾擾五種常見的相關疾病 VF-101，分別是肺動脈高壓，心肌缺血，肺動脈高壓（原發性，1，遺傳性出血性毛細血管擴張），特發性肺動脈高壓和脂肪性肝炎（補充圖 S2D）。

此外，進行 PCA  分析以比較對低劑量和高劑量 VF-101（圖 1E，F）。PC1  可以主要描述高劑量治療的轉錄組學特徵，而 PC2  可以描述低劑量治療的轉錄組學特徵（圖 1E）。每個主成分（PC）上的基因加載分數可以證明該基因在 PC 中的分佈，或者換句話說，該基因在樣本中的表達模式。正加載分數表明基因表達和 PC 呈正相關。在 PC1 的情況下，由於高劑量的表達譜 VF-101 處理中富含陽性 PC1，在 PC1 中具有正負荷評分的基因傾向於上調，類似於 PC2  和低劑量的 VF-101 治療反應概況。負加載分數表示負相關；因此，負負荷分數的基因可能被下調。更高的（正或負）加載分數演示對那台 PC 產生更強的影響。兩台 PC  的加載分數分佈如圖 1F  所示。一般來說，與鐵穩態相關的基因包括 FTH1  和SLC7A11 編碼 xCT 兩種劑量均上調 VF-101，表明對鐵死亡有保護作用。有趣的是，IL6 也被兩種劑量的VF-101，與對照相比，表明 VF-101 阻斷 IL-6 信號通路以抑制細胞因子風暴。此外，纖連蛋白 (FN1) 的表達水平可能會隨著高劑量而降低 VF-101 治療，表明對纖維化的抑製作用。這些基因表達的改變是在後來的實驗中得到驗證。

VF-101 顯著上調靶向影響 SARS-CoV-2 的 miRNA

由於上調 let-7a-5p 和 miR-148b-5p 的表達可能對治療 COVID-19 有益（Xie 等人， 2021），的影響 VF-101 對這些 miRNA  的表達進行了研究。此外，PC1 PCA  分析中負載得分為正的前 100 個基因在包含鏡像庫 let-7a-5p 目標（p 值 = 0.002；分析由 CPDB 執行）。

首先，最高安全劑量 VF-101通過在 96孔板中處理不同濃度的 BEAS-2B 細胞 24 小時並使用 SRB 測定評估細胞活力來確定。處理過的細胞保持超過 80% 的存活率（補充圖S3）。這 qRT-PCR 結果顯示，低劑量的 VF-101  （33.3 微克/ml）可以顯著增加 miR-148b-5p 表達 3.71倍（圖 2A），而高劑量的 VF-101（333 微克/ml）可以將 let-7a-5p  表達增加1.63  倍（補充圖 S4）。這些結果表明 VF-101  可以以與劑量無關的方式上調靶向 miRNA的表達。